紫外可見分光光度計的應用
1.概述
人們在實踐中早已總結出不同顏色的物質具有不同的物理和化學性質。根據物質的這些特性可對它進行有效的分析和判別。由于顏色本就惹人注意，根據物質的顏色深淺程度來對物質的含量進行估計，可追溯到古代及中世紀。1852年，比爾（Beer）參考了 布給爾（Bouguer）1729年和朗伯（Lambert）在1760年所發表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎，這就是著名的比爾朗伯定律。1854年，杜包斯克（Duboscq）和奈斯勒（Nessler）等人將此理論應用于定量分析化學領域，并且設計了第一臺比色計。到1918年，美國國家標準局制成了第一臺紫外可見分光光度計。此后，紫外可見分光光度計經不斷改進，又出現自動記錄、自動打印、數字顯示、微機控制等各種類型的儀器，使光度法的靈敏度和準確度也不斷提高，其應用范圍也不斷擴大。
紫外可見分光光度法從問世以來，在應用方面有了很大的發展，尤其是在相關學科發展的基礎上，促使分光光度計儀器的不斷創新，功能更加齊全，使得光度法的應用更拓寬了范圍。目前，分光光度法已為工農業各個部門和科學研究的各個領域所廣泛采用，成為人們從事生產和科研的有力測試手段。我國在分析化學領域有著堅實的基礎，在分光光度分析方法和儀器的制造方面國際上都已達到一定的水平［1］［2］
2.原理
物質的吸收光譜本質上就是物質中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應地發生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結果。由于各種物質具有各自不同的分子、原子和不同的分子空間結構，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據吸收光譜上的某些特征波長處的吸光度的高低判別或測 定該物質的含量，這就是分光光度定性和定量分析的基礎。分光光度分析就是根據物質的吸收光譜研究物質的成分、結構和物質間相互作用的有效手段。
紫外可見分光光度法的定量分析基礎是朗伯-比爾（Lambert-Beer）定律。即物質在一定濃度 的吸光度與它的吸收介質的厚度呈正比，其數學表示式如下：
A=錬c
式中：A—吸光度（又稱光密度、消光值），
å—摩爾吸光系數（其物理意義為：當吸光物質濃度為1摩爾/升，吸收池厚為1厘米，以一定波長原光通過時，所引起的吸光值A），b—吸收介質的厚度（厘米），c—吸光物質的 濃度（摩爾/升）。
物質的顏色和它的電子結構有密切的關系，當輻射（光子）引起電子躍遷使分子（或離子）從基態上升到激發態時，分子（或離子）就會在可見區或紫外呈現吸光，顏色的發生或變化是和分子的正常電子結構的變形聯系的。當分子中含有一個或更多的生色基因（即具有不飽和鍵的原子基團），輻射就會引起分子中電子能量的改變。常見的生色團有：
CO， -N=N-， -N=O，-C N，CS
如果兩個生色團之間隔一個碳原子，則形成共軛基團，會使吸收帶移向較長的波長處（即紅移），且吸收帶的強度顯著增加。當分子中含有助色基團（有未共用電子對的基團）時，也會 產生紅移效應。常見的助色基團有：-OH -NH2， -SH， -Cl, -Br, -I
3.特點
分光光度法對于分析人員來說，可以說是最有用的工具之一。幾乎每一個分析實驗室都離不開紫外可見分光光度計。分光光度法的主要特點為：
（1）應用廣泛
由于各種各樣的無機物和有機物在紫外可見區都有吸收，因此均可借此法加以測定。到目前為止，幾乎化學元素周期表上的所有元素（除少數放射性元素和惰性元素之外）均可采用此法 。在國際上發表的有關分析的論文總數中，光度法約占28%，我國約占所發表論文總數的33% 。
（2）靈敏度高
由于新的顯色劑的大量合成，并在應用研究方面取得了可喜的進展，使得對元素測定的靈敏度有所推進，特別是有關多元絡合物和各種表面活性劑的應用研究，使許多元素的摩爾吸光系數由原來的幾萬提高到數十萬。
（3）選擇性好
目前已有些元素只要利用控制適當的顯色條件就可直接進行光度法測定，如鈷、鈾、鎳、銅、銀、鐵等元素的測定，已有比較滿意的方法了。
（4）準確度高
對于一般的分光光度法，其濃度測量的相對誤差在1～3%范圍內，如采用示差分光光度法進行測量，則誤差可減少到0.X%。
（5） 適用濃度范圍廣
可從常量（1%～50%）（尤其使用示差法）到痕量（10-8～10-6%）（經預富集后）。
（6） 分析成本低、操作簡便、快速
由于分光光度法具有以上優點，因此目前仍廣泛地應用于化工、冶金、地質、醫學、食品、制藥等部門及環境監測系統。單在水質分析中的應用就很廣，目前能有直接法和間接法測定的金屬和非金屬元素就有70多種。
4 應用
4.1 檢定物質
根據吸收光譜圖上的一些特征吸收，特別是最大吸收波長雖ax和摩爾吸收系數澹是檢定物質的常用物理參數。這在藥物分析上就有著很廣泛的應用。在國內外的藥典中，已 將眾多的藥物紫外吸收光譜的最大吸收波長和吸收系數載入其中，為藥物分析提供了很好的手段。
4.2 與標準物及標準圖譜對照
將分析樣品和標準樣品以相同濃度配制在同一溶劑中，在同一條件下分別測定紫外可見吸收光譜。若兩者是同一物質，則兩者的光譜圖應完全一致。如果沒有標樣，也可以和現成的標準譜圖對照進行比較。 這種方法要求儀器準確，精密度高，且測定條件要相同。
4.3 比較最大吸收波長吸收系數的一致性
由于紫外吸收光譜只含有2～3個較寬的吸收帶，而紫外光譜主要是分子內的發色團在紫外區產生的吸收，與分子和其它部分關系不大。具有相同發色團的不同分子結構，在較大分子中不影響發色團的紫外吸收光譜，不同的分子結構有可能有相同的紫外吸收光譜，但它們的吸收系數是有差別的。如果分析樣品和標準樣品的吸收波長相同，吸收系數也相同，則可認為分析樣品與標準樣品為同一物質。
例1 己二烯-1，5（CH2=CHCH2CH2=CH2）的最大吸收波長雖ax為178nm（摩爾吸收系數為26000），而己烯-1（CH2=CHCH2CH2CH2CH3）的最大吸收波長為雖ax 為177nm（摩爾吸收系數邐11800）。此兩個物質有相同的發色團，雖ax值基本相同，但值不同，二烯的逯當鵲ハ┑拇蟆Ｕ饉得饔邢嗤牡舜瞬還查畹姆⑸牛湮詹ǔそ詠 于單個發色團的值，但逯翟蛩嫦嗤⑸攀康腦黽傭黽印Ｈ綣屑父齜⑸瘧舜斯查，則吸收長向紅移動。象丁二烯-1，3（CH2=CHCH=CH2）與己二烯-1，5（CH2=CHCH2 CH2CH=CH2）相比，同樣有兩個雙鍵，但丁二烯-1，3中為共軛體系，它的最大吸收長雖 ax為210nm，而摩爾吸收系數逯翟蠐爰憾-1，5基本一樣。
4.4 純度檢驗
例2 紫外吸收光譜能測定化合物中含有微量的具有紫外吸收的雜質。如果化合物的紫外可 見光區沒有明顯的吸收峰，而它的雜質在紫外區內有較強的吸收峰，就可以檢測出化合物中的雜質。
例3 檢測乙醇樣品含有的苯的雜質。苯的最大吸收波長在256nm，而乙醇在此波長處沒有 吸收。在紫外吸收光譜上就能很明顯地看出來。
如果化合物在紫外可見有吸收，可用吸收系數檢測其純度。
例4 菲的氯仿溶液在296 nm處有強吸收，邐12600，log 邐4.10，用某方法精制的菲在紫外上測出的1og 逯當缺曜嫉姆埔10%，這說明實際含量只有90%，其余的就很有可能是 雜質了。
例5 還可以用差示法來檢測樣品的純度。取相同濃度的純品在同一溶劑中測定作空白對照 ，樣品與純品之間的差示光譜就是樣品中含有雜質的光譜。
4.5 推測化合物的分子結構
（1） 推測化合物的共軛體系和部分骨架
如果一個化合物在紫外區是透明的，沒有吸收峰（吸收系數澹10），則說明不存在共軛體系 （指不存在多個相間雙鍵）。它可能是脂肪族碳氫化合物、胺、腈、醇等不含雙鍵或環狀結構 的化合物。
如果在210-250nm有強吸收，則可能有兩個雙鍵共軛系統（如共軛二烯或幔-不飽和酮）。
如果在250-300nm有強吸收，則可能具有3-5個不飽和共軛系統。
如果在260-300nm有中強吸收（吸收系數=200-1000），則可能有苯環。
如果在250-300nm有弱吸收，則可能存在羰基基團
（2） 區分化合物的構型和構象
例6 化合物二苯乙烯有順式和反式兩種構型：
它們的最大吸收波長和吸收強度都不同，由于反式構型沒有空間障礙，偶極矩大，而順式構型有空間障礙，因此反式的吸收波長和強度都比順式的來得大。為此就很容易區分順式和反式構型了。
（3）互變異構體的鑒別。
在有機化學中，會有異構體的互變現象，通過紫外光譜也可鑒別。
例7 異丙基酮有兩種分異構體：
CH3CCH3CHCOCH3
CH2CCH3CH2COCH3
（a） （b）
在紫外吸收光譜上，由于（a）的分子結構中碳碳雙鍵和羰基處于共軛體系，故在235nm處有強吸收（=12000），而（b）的分子結構中的碳碳雙鍵和羰基不存在共軛體系，故在220nm以上沒 有強吸收。
例8 乙酰乙酸乙酯有酮式和烯醇式兩種變異構體：
CH3COCH2COO C2H5
（酮式）
CH3COH··CHCCH2 HO
（烯醇式）
烯醇式結構中羰基和主鏈的雙鍵共軛，其雖an為245nm（邐18000），而酮式結構中沒有共軛體系，故在210nm以上沒有強吸收帶。在極性溶劑（例如水）中，酮式結構與溶劑分子因形 成氫鍵而被穩定，故在極性溶劑中以酮式結構為主（約占85%），而在非極性溶劑（例如正乙烷 ）中，烯醇式因生成分子內氫而被穩定，故在非極性溶劑中以烯醇式結構為主，在正乙烷溶劑中烯醇式結構約占96%。這種互變異構的轉換情況在紫外光譜就很容易看出來。
4.6 氫鍵強度的測定
實驗證明，不同的極性溶劑產生氫鍵的強度也不同，這可以利用紫外光譜來判斷化合物在不同溶劑中氫鍵強度，以確定選擇哪一種溶劑。
例9 在例6中提到的異丙基丙酮在溶劑環己烷（非極性溶劑）、乙醇、甲醇和水中的雖an分 別為335、320、312和300nm。假定這種雖an完全由溶劑的氫鍵所引起，則可以利用下式計算每種溶劑中的氫鍵強度。對每種情況，紫外輻射每摩爾能量為
E=Nh=Nhc/ë
式中：N—阿佛加德羅常數，N=6.023×1023；
h—普朗克常數，h=6.62×10-34J·s；
c—光速c=3×1010cm/s
對于環已烷，雖ax=335nm=33510-7cm；
因此 ，紫外輻射能量N=（6.023×1023×6.62×10-34）/（335×10-7）=3. 57×105J/mol
同樣可求得乙醇、甲醇和水中的紫外輻射能量分別為3.74×105、3.83×105、3.98×1 05J/mol。將這些輻射能扣除在非極性溶劑中的輻射能后，便得到在這些極性溶劑中的氫鍵強度：
在乙醇中氫鍵強度為
3.74×105-3.57×105=1.7×104J/mol
在甲醇中3.83×105-3.57×105=2.6×104J/mol
在水中3.98×105-3.57×105=4.1×104J/mol
4.7 絡合物組成及穩定常數的測定
金屬離子常與有機物形成絡合物，多數絡合物在紫外可見區是有吸收的，我們可以利用分光光度法來研究其組成。當金屬離子M和配位體L（在這兒往往是顯色劑）形成絡合物ML時，絡合 物反應如下：
M+nR=MRn
當達到絡合平衡時，其絡合物穩定常數為：
K=CMRn/（CMCR）
若M與R不干擾MRn的吸收，且其分析濃度分別為CM、CR，那么固定金屬離子M的濃度，改變顯色劑R的濃 度，就可以得到一系列CM/CR值不同的溶液。在適宜的波長條件下測量各溶液的吸光度，然后以吸光度A對CM/CR 作圖。當加入的試劑R還沒有使M定量轉化為M Rn時，該曲線處于直線階段，當加入的試劑R已使M定量轉化為MRn。并稍有了過量時，曲線便出現轉折，加入的R繼續過量，曲線又是水平直線。那么轉折點所對應的摩爾比數即是絡合物的組成比。若絡合物比較穩定，則轉折點明顯。若絡合物不穩定，則轉折點不明顯，此時可用外推法求得兩條直線的交點，交點對應的CM/CR值即為絡合物MRn中的n值。
如果在兩種不同的金屬離子和配位體總濃度（總摩爾數）的條件下，在同一坐標上分別作吸光度對兩種不同總摩爾數的溶液組成曲線，在曲線上找出吸光度相同的兩點，則在此兩點上對應的絡合物濃度應相同，為此便可通過計算出絡合物穩定常數K。
4.8 反應動力學研究
借助于分光光度法可以得出一些化學反應速度常數，并從兩個或兩個以上溫度條件下得到的速度數據，得出反應活化能。在丙酮的溴化反應的動力學研究中就是一個成功的例子。
例10 在有機化學中，丙酮的溴化反應是一個復雜反應，其反應式為：
CH3COCH3 +Br2
CH3COCH2Br+Br-+H+
該反應由氫離子催化，則反應速度為：
K=k［CH3COCH3］p［Br2］q［H+］r
式中：k—反應速度常數
物質的濃度（摩爾/升）
指數p、q、r分別表示丙酮、溴、氫離子的反應級數
在其它試劑沒有明顯吸收的波長下，用分光光法在400nm處直接觀察Br2濃度的減小，就很 容易跟蹤反應進程。對于固定的吸收池的厚度，吸光度A就與Br2的濃度呈正比，令比例系數為B，則存在下式：
A=BC
通過一系列的實驗，便可得出反應速度k及反應級數來，實驗證明對Br2是零級，即q等于 零。若測出兩個或兩個以上溫度的速度常數（k1、k2），則可根據阿侖尼烏斯公式計算出反應活化能來。
Log k2/k1 =E0（T2/T1）/2.30 RT1T2
式中：k1、k2分別為溫度T1、T2下的反應速度常數
R為氣體常數，8.314焦耳/開爾文·摩爾
E0為活化能
4.9 在有機分析中的應用
有機分析是一門研究有機化合物的分離、鑒別及組成結構測定的科學，它是在有機化學和分析化學的基礎上發展起來的綜合性學科。在國民經濟的許多領域都用有機分析。［3］
波長在190-800nm的電磁光譜對于判斷有機分子中是否存在共軛體系、芳環結構及C=C、C=O 、N=N之類的發色團是一個很好的手段。具有鵂繾蛹骯查釧幕銜鐫謐賢馇星烈的吸收，其摩爾吸光系數可達104-105（而紅外吸收光譜的摩爾吸光系數一般均小于10 3），因而檢測靈敏度很高。對于一些特列類型的結構，可通過簡單的數學運算確定最大吸 收。如果發色團之間不以共軛鍵相連的話，其紫外吸收具有可加性，即總的吸收等于各單獨發色團的吸收之和。用此性質曾成功地推導出利血平及氯霉素的部分結構。一個復雜分子的結構，往往可以由比較化合物的紫外光譜性質而推斷其含有何種發色團，有時還能提供一些立體結構及分子量的一些信息，為未知物的剖析提供有用的線索。以下通過一些實例說明分光光度法在有機分析中的應用。
例11 氯霉素分子中的硝基首先是由它的紫外光譜而確定的，在紫外光譜中298nm和278nm處 出現芳香硝基的特征吸收。
五圓環酮和羧酸酯的紅外特征吸收都在1740cm-1附近，難以區別。但在紫外光譜中只有前者在210nm以上有吸收，從而得以區別。
例12 利用紫外分光光度法進行定量分析時，可將待測試樣的純品配制成一系列標準溶液 ，事先繪制標準曲線，由待測未知樣品吸光度對照標準曲線，就可得到其含量。當未知物樣品為幾種組分，且這組分的雖ax互不重疊，則可用聯立方程解之。如復方阿司匹林（ A.P.C）含有三種組分：阿司匹林（A）、非那西丁（P）、咖啡因（C），阿司匹林和咖啡因的最大吸收在277nm和275nm，較為接近，必須事先分離，而咖啡因和非那西丁的最大吸收相距較 遠，可用聯立方程解之。將待分析的藥片粉碎并溶于氯仿中，用4% 的碳酸鈉水溶液萃取兩次，用蒸餾水洗滌一次，合并水層。則阿司匹林進入水層，非那西丁和咖啡困留在氯仿中。再用氯仿洗滌水層三次，進一步提取水層中殘留的非那西丁和咖啡因。合并氯仿層，并過濾到250mL容量瓶中，用氯仿稀釋至刻度。最后移取1mL此液到100mL容量瓶中，用氯仿稀釋至 刻度。取此液在250nm和275nm處測定吸光度。分別測得為0.795和0.280。水層用稀酸酸化（p H為2），用氯仿萃取后，將萃取液轉入100mL容量瓶，以氯仿稀釋至刻度，在277nm處測其吸 光度為0.78。通過配制的已知濃度的樣品可求出100mg/L的阿司匹林在277nm處的吸光度為0. 72，可知待測樣品中的阿司匹林的含量為100×0.78/0.72=108mg/L，也就是10.8mg/100mL， 即藥片含阿司匹林10.8g。對標準的非那西丁溶液，測得其比吸光系數為k250=0.0767 L/mg.cm,k275=0.0200L/mg.cm對標準的咖啡因溶液，測得其比吸光系數為k250 =0.0177L/mg.cm,k275=0.0518L/mg.cm由此可列出聯立方程，解得咖啡因濃度為1 .55mg/L，即0.155mg/100mL非那西丁濃度為10.1mg/L,即1.01mg/mL，由于未知溶液稀釋了250倍，所以藥片中含非那西丁的量為1.01×250=252mg，含咖啡因的量為0.155×2 50=38.8mg。
同樣，甲苯酚中的甲基和羥基因位置不同有鄰、間、對三種異構體，它們有各自不同的吸收譜帶，可分別在波長277、273、268nm處測定光度，解聯立方程即可算出混的中各自組分的含量。
例13 通過對兩個有機化合物（以環已烷為溶劑）的紫外光譜比較，發現（Ⅱ）的紫外光譜中26 0nm處的吸收峰與（Ⅰ）的相比大為減弱，從而表明空間位阻效應的存在。這是由于有機化合物（Ⅱ）中分子中心單鍵的鄰位上有了兩個體積較大的取代基（甲氧基），使兩個苯環以中心鍵 為軸，發生扭曲而不能處于同一個平面內，此時共軛關系受到很大影響，故使反應苯環下鍵為特征的260nm處的吸收就大大減弱了。
例14 在有機化合物（Ⅲ）中，由于兩個苯環上相互處于鄰位的四個甲基的位阻效應，使得兩個苯環不能處于同一個平面內，其間的共軛關系被破壞。反映在其紫外光譜上，此化合物的紫外光譜很近似地等于兩個孤 立的間三甲苯? ? 光譜之和， 而與二聯苯? 的吸收光譜無關。
例15 制備衍生物也是擴大紫外光譜應用范圍的一個途徑。我們可以利用紫外光譜測定有機 物胺類化合物（RNH2）的分子量。RNH2本身在紫外區是沒有吸收的，但可以利用化學反應制備 衍生物，引入一個新的共軛系統。
反應產生的胺苦味酸鹽（1+1加成產物）在紫外有吸收。當波長為380nm時，大多數的胺苦味酸鹽在95%乙醇中的摩爾吸光度系數大致相同，均在1.344×104，因此我們 就可以從苦味酸鹽的乙醇溶液在380nm處的吸收，由公式計算出胺苦味酸鹽的分子量，進而再折成未知胺的分子量。
例如，用此方法測定古柯堿的分子量，將古柯堿苦味酸鹽2.159mg溶于100mL95%乙醇溶液中，在1厘米厚吸收池中測得其吸光度為0.550，又知苦味酸的分子量為229，這樣就可 以計算出古柯堿的分子量為
M=13440×2.519×10/（1000×0.550）-229=299
按古柯堿分子式（C11H21O4N）計算的話，其分子量應為303，與此法計算出的分子量的偏差僅為-0.8%。
用此方法測定各類化合物的衍生物及分子量的有關數據如表1所示。
表1 分光光度法測各類化合物分子量的數據
化合物衍生物雖ax（nm）Emax
胺苦味酸鹽38013440
飽和醇-2,4二硝基苯丙酸酯24214440
醛和酮2，4二硝基苯腙36022000
糖脎39720360
乙醇分子中不存在共軛系統，它在波長200-800nm范圍內是沒有吸收的，當乙醇與異氰酸苯酯（Ar-N=C=O）反應后，在波長280nm處就會出現較強的吸收。
例16 有時很強的吸收會引起干擾作用，象有些稠環化合物對某些波長的吸收就很強，也可 以采用化學鴟從θコＨ纈謝銜鏍煬哂腥齟箴鍵，在波長252nm處有很強的吸收，其摩爾吸光系數可達2×105會對一些在此也有吸收的化合物產生干擾，我們可以讓 它與丁烯二酸酐發生狄爾斯-阿爾德（Diels-Alder）加成反應：
這樣一來，原來三個大鵂查釹低塵捅黃蘋盜耍群芮康奈站捅淮蟠蠹躒趿恕£
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